«Διαγονιδιακά Ζώα»

Άρθρο του Π. Υψηλάντη
Πέτρος Υψηλάντης
Επίκουρος Καθηγητής Πειραματικής Χειρουργικής
Ιατρικής Σχολής, Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης, Aλεξανδρούπολη

Ανακοινώθηκε στο 1o ΔΙΕΘΝΕΣ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ
Αλεξανδρούπολη, 12-14 Μαϊου 2006


EIΣΑΓΩΓΗ
Tα διαγονιδιακά ζώα παράγονται από την εσκεμμένη εισαγωγή ξένου DNA στο γονιδίωμα ενός ζώου δέκτη. Το ξένο DNA πρέπει στη συνέχεια να μεταδοθεί διαμέσου των γεννητικών κυττάρων προκειμένου κάθε κύτταρο να περιέχει το ίδιο τροποποιημένο γενετικό υλικό και να μπορεί να κληρονομηθεί στις επόμενες γενεές. Η εισαγωγή DNA μπορεί να οδηγήσει στην υπερ- ή υπο-έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων ή στην έκφραση νέων γονιδίων για το είδος του ζώου.

ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ
To 1974 δημιουργήθηκε ο πρώτος χιμαιρικός μυς (1). Τα κύτταρα δύο εμβρύων διαφορετικών φυλών ενώθηκαν σε αρχική φάση της ανάπτυξής τους (στάδιο 8 κυττάρων) και δημιούργησαν μία χίμαιρα, η οποία έφερε τα χαρακτηριστικά και των δύο φυλών. Έκτοτε, η εξέλιξη στους τομείς της αναπτυξιακής βιολογίας και της γενετικής μηχανικής επέτρεψε τη ραγδαία ανάπτυξη των τεχνικών για τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων.

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ
Oι βασικοί τομείς στους οποίους βρίσκουν εφαρμογή τα διαγονιδιακά ζώα είναι:

Κτηνοτροφία

(α) Γενετική βελτίωση. Με τη βοήθεια των διαγονιδιακών ζώων δημιουργούνται φυλές παραγωγικών ζώων με επιθυμητά χαρακτηριστικά (υψηλή γαλακτοπαραγωγή, υψηλός ρυθμός ανάπτυξης κλπ), σε συντομότερο χρόνο και με μεγαλύτερη ακρίβεια συγκριτικά με τις κλασσικές μεθόδους γενετικής βελτίωσης.

(β) Αύξηση παραγωγικότητας. Δημιουργούνται διαγονιδιακές αγελάδες που παράγουν περισσότερο γάλα ή γάλα με λιγότερη λακτόζη ή χοληστερόλη, διαγονιδιακοί χοίροι και βοοειδή με μεγαλύτερη αναλογία μυϊκής μάζας και πρόβατα που παράγουν περισσότερο μαλλί.

(γ) Ανθεκτικότητα στις ασθένειες. Γίνεται προσπάθεια να δημιουργηθούν ζώα ανθεκτικά σε ασθένειες, όπως π.χ. χοίροι ανθεκτικοί στην Influenza. Ωστόσο, για την ώρα είναι γνωστός μόνο περιορισμένος αριθμός γονιδίων που ευθύνονται για την εμφάνιση ανθεκτικότητας σε νοσήματα των παραγωγικών ζώων.

Ιατρική

(α) Μοντέλα μελέτης ανθρώπινων παθήσεων.  Ένας βασικός τομέας της ιατρικής στον οποίο βρίσκουν εφαρμογή τα διαγονιδιακά ζώα είναι εκείνος της δημιουργίας μοντέλων για τη μελέτη παθήσεων του ανθρώπου. Με την επιλεκτική εισαγωγή, αφαίρεση ή τροποποίηση συγκεκριμένων γονιδίων από το γονιδίωμα ζώων εργαστηρίου δημιουργούνται φυλές ιδανικές για τη μελέτη ανθρώπινων νόσων. Γενετικώς τροποποιημένα ζώα χρησιμοποιούνται ως μοντέλα για τη μελέτη ασθενειών όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob (νόσος των τρελών αγελάδων), το AIDS, ο καρκίνος κλπ. Επίσης,  παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη νέων μεθόδων θεραπείας αυτοάνοσων νοσημάτων όπως ο εφηβικός σακχαρώδης διαβήτης, η σκλήρυνση κατά πλάκας, η νόσος Alzheimer κλπ. Παραδείγματα γενετικώς τροποποιημένων ζώων εργαστηρίου που χρησιμοποιούνται ως πειραματικά μοντέλα  στην έρευνα είναι :  

Nude mouse. Πρόκειται για φυλή μυών με συγγενή αλωπεκίαση στην οποία υπάρχει μικρός ή μηδενικός αριθμός συγκεκριμένου τύπου ανοσοκυττάρων έτσι ώστε να ευνοείται η ανάπτυξη όγκων.
Knockout mice:  Διαγονιδιακές φυλές μυών στις οποίες έχει απενεργοποιηθεί ένα συγκεκριμένο γονίδιο.
Pigmentary mutants: Μελαγχρωστικά μεταλλαγμένα ποντίκια τα οποία έχουν ποικίλα χρώματα δέρματος.
Homozygous Rhino mouse: Στις φυλές αυτές το δέρμα των μυών στην ηλικία των 3 εβδομάδων αποτελείται από μικρούς σωληνίσκους οι οποίοι με την πάροδο της ηλικίας σχηματίζουν εν τω βάθει δερματικές κύστεις. Έτσι, δημιουργούνται μοντέλα μελέτης του κύκλου ζωής της τρίχας.

(β) Δημιουργία ξενομοσχευμάτων. Διαγονιδιακοί χοίροι θα μπορούν να παράγουν ιστούς ή ακόμη και όργανα ως ξενομοσχεύματα για μεταμοσχεύσεις στον άνθρωπο. Για την ώρα υπάρχουν ακόμη τεχνικά προβλήματα στην ανάπτυξη της ξενομεταμόσχευσης.

(γ) Παραγωγή διατροφικών συμπληρωμάτων και φαρμακευτικών ουσιών. Βιολογικές ουσίες όπως η ινσουλίνη, η αυξητική ορμόνη, αντιπηκτικοί παράγοντες του αίματος θα μπορούν σύντομα να παράγονται ή παράγονται ήδη από το γάλα διαγονιδιακών αγελάδων, προβάτων ή αιγών. Η έρευνα κατευθύνεται επίσης προς την παραγωγή γάλακτος που θα χρησιμοποιείται στη θεραπεία ασθενειών όπως η φενυλενοκετονουρία, η κυστική ίνωση κλπ.

(δ) Γονιδιακή θεραπεία. Η γονιδιακή θεραπεία βασίζεται στην προσθήκη ενός φυσιολογικού αντιγράφου ενός ανασυνδυασμένου γονιδίου στο γονιδίωμα ενός ατόμου που φέρει ελαττωματικά αντίγραφα του γονιδίου. Τα διαγονιδιακά ζώα μπορούν να παίξουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της επιστήμης στον τομέα αυτό.

(ε) Τοξικολογικές δοκιμασίες. Έχουν δημιουργηθεί ευαίσθητα σε τοξικές ουσίες διαγονιδιακά ζώα, τα οποία χρησιμοποιούνται σε τοξικολογικές δοκιμασίες.

Βιομηχανία
Τα διαγονιδιακά ζώα μπορούν να παράγουν προϊόντα χρήσιμα στη βιομηχανία. Το 2001 στον Καναδά κατάφεραν να εισάγουν γονίδια αράχνης σε κύτταρα αιγών οι οποίες άρχισαν να παράγουν μετάξι στο γάλα τους. Η παραγωγή πολυμερούς νήματος με το γάλα μπορεί να βρει εφαρμογή στην παραγωγή νήματος μικρού βάρους, ανθεκτικού και εύκαμπτου για την παραγωγή στρατιωτικών στολών, νημάτων χειρουργείου κλπ.

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΖΩΩΝ
Τρεις είναι οι βασικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων.
1.    Η μικροέγχυση DNA στον προπυρήνα γονιμοποιημένων ωαρίων
2.    Η μεταφορά γονιδίων διαμέσου εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων
3.    Η μεταφορά γονιδίων διαμέσου ρετροϊών – φορέων
    
1. Η μικροέγχυση DNA στον προπυρήνα γονιμοποιημένων ωαρίων
Η τεχνική της μικροέγχυσης DNA χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά με επιτυχία στα θηλαστικά και συγκεκριμένα στον μυ (ποντικό) το 1981 (2), ενώ στη συνέχεια εφαρμόστηκε και σε άλλα είδη ζώων όπως ο επίμυς, το κουνέλι, το πρόβατο, ο χοίρος, τα πτηνά και τα ψάρια. Αποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Σύμφωνα με αυτή, γίνεται  άμεση μικροέγχυση ενός ή συνδυασμού γονιδίων από ένα ζώο του ίδιου ή άλλου είδους στον προπυρήνα ενός γονιμοποιημένου ωαρίου ενός ζώου δέκτη. Το ξένο DNA πρέπει να ενσωματωθεί στον γονιδίωμα πριν από το διπλασιασμό του γενετικού υλικού, που προηγείται της πρώτης διαίρεσης, προκειμένου το ζώο που θα γεννηθεί να φέρει ένα αντίγραφο της νέας πληροφορίας σε κάθε κύτταρό του. Το ξένο DNA μπορεί να εγχυθεί είτε στον ένα είτε στον άλλο προπυρήνα με το ίδιο αποτέλεσμα. Ωστόσο, συνήθως επιλέγεται ο  αρσενικός προπυρήνας γιατί είναι ελαφρώς μεγαλύτερος και βρίσκεται πιο κοντά στην επιφάνεια του ωοκυττάρου. Τα έμβρυα μεταφέρονται στη συνέχεια στον ωαγωγό ενός ζώου δέκτη προκειμένου να παραχθούν δυνητικοί διαγονιδιακοί απόγονοι (3).
Πιο αναλυτικά, τα στάδια της μικροέγχυσης DNA περιλαμβάνουν (α) την πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας, (β) την απομόνωση του ζυγωτού, (γ) τη μικροέγχυση DNA, (δ) την επανεμφύτευση των εμβρύων και (ε) τον γενοτυπικό έλεγχο των απογόνων.

(α) Αρχικά, στα θηλυκά ζώα δότες εμβρύων γίνεται αγωγή με γοναδοτρόπες ορμόνες για την πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας. Χρησιμοποιούνται ορμόνες όπως FSH-LH, HCG ή PMSG. Στη συνέχεια οι δότες οδηγούνται για σύζευξη με γόνιμα αρσενικά, κατά τη διάρκεια της νύχτας, προς παραγωγή ζυγωτών.

(β) 24 ώρες μετά την ορμονική αγωγή, οι ωαγωγοί αφαιρούνται, υπό γενική αναισθησία, και συλλέγονται τα ζυγωτά (έμβρυα σταδίου ενός κυττάρου) με έκπλυση των ωαγωγών. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι στον επίμυ λαμβάνονται συνήθως 20-80 γονιμοποιημένα ωάρια ανά ζώο. Στη συνέχεια προετοιμάζονται τα ζυγωτά για τη μικροέγχυση. Αρχικά επωάζονται σε ένα διάλυμα πρωτεάσης προκειμένου να απομακρυνθεί η διαφανής ζώνη και ακολουθεί πλύση τους με καλλιεργητικό υγρό.

(γ) Τα ζυγωτά με ζεύγος προπυρήνων επιλέγονται για μικροέγχυση, συγκρατώνται με μία πιπέτα και στη συνέχεια διατρυπώνται με τη βοήθεια πιπέτας μικροέγχυσης που περιέχει διάλυμα DNA. Εγχύονται λίγα picolitters διαλύματος DNA σε έναν από τους προπυρήνες. Ένα ή περισσότερα αντίγραφα του ανασυνδυασμένου γονιδίου εισέρχονται τυχαία σε κάποιο ρήγμα του γονιδιώματος του ζώου.

(δ) Ακολουθεί επανεμφύτευση των εμβρύων στον ωαγωγό ενός ζώου δέκτη προκειμένου να παραχθούν διαγονιδιακοί απόγονοι. Στον επίμυ, τα ζυγωτά επανεμφυτεύονται σε ομάδες των 20-25 σε κάθε ωαγωγό. Οι δέκτες είναι συνήθως ζώα σε ψευδοκύηση η οποία προκαλείται μετά από συζευξη τους με αρσενικά στα οποία έχει διενεργηθεί εκτομή του σπερματικού πόρου.

(ε) Τέλος, προσδιορίζεται ο γενότυπος κάθε απογόνου, με διάφορες τεχνικές γενετικής, ώστε να επιβεβαιωθεί η μεταβολή ή όχι του γενετικού του υλικού.

Σε ειδικές περιπτώσεις, εφαρμόζονται τεχνικές in vitro γονιμοποίησης ή/και συντήρησης σε βαθιά κατάψυξη προκειμένου να διατηρηθούν ή να συνεχιστούν σημαντικές σειρές ζώων (4).  Mε αυτόν τον τρόπο αυξάνεται η περίοδος αξιοποίησης των διαγονιδιακών ζώων. Οι μέθοδοι αυτές βρίσκουν ιδιαίτερη εφαρμογή σε αρσενικά διαγονιδιακά ζώα, δεδομένου ότι το σπέρμα τους μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την in vitro γονιμοποίηση μεγάλου  αριθμού ωαρίων. Πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα περιλαμβάνουν την ενδοκυτταροπλασματική έγχυση κατεψυγμένων – αποψυγμένων πυρήνων σπερματοζωαρίων  (5).

2. Mεταφορά γονιδίων διαμέσου εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων
Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα προέρχονται από την εσωτερική μάζα κυττάρων (inner cell mass) της βλαστοκύστης και είναι πολυδύναμα αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν τη δυνατότητα τα εξελιχθούν σε οποιονδήποτε τύπο κυττάρου. Σύμφωνα με τη μέθοδο, που αναπτύχθηκε για πρώτη φορά το 1986 (6), εισάγεται η επιθυμητή ακολουθία DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό (homologous recombination) σε in vitro καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων τα οποία έχουν αφαιρεθεί από μία βλαστοκύστη. Τα γενετικώς τροποποιημένα βλαστικά κύτταρα εγχύονται στη συνέχεια σε μία νέα βλαστοκύστη. Αποτέλεσμα είναι η δημιουργία χίμαιρας (ενός οργανισμού που αποτελείται από κύτταρα ποικίλης γενετικής σύνθεσης - γενετικώς τροποποιημένα και φυσιολογικά κύτταρα). Τα χιμαιρικά ζώα που προκύπτουν θα μεταδώσουν τελικά τον ανασυνδυασμένο γενότυπο στους απογόνους τους, μόνο εάν τα τροποποιημένα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα έχουν συμβάλει στο σχηματισμό των γεννητικών κυττάρων τους. Η τεχνική αυτή έχει το πλεονέκτημα της ακριβούς τροποποίησης του γονιδιώματος με τη μέθοδο του ομόλογου ανασυνδυασμού, και δίνει τη δυνατότητα εισαγωγής, απομάκρυνσης ή τροποποίησης συγκεκριμένων ακολουθιών DNA με αποτέλεσμα τη δημιουργία μοντέλων υψηλής ακρίβειας για τη βιοϊατρική έρευνα.
Mία εναλλακτική μέθοδος για την τεχνολογία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων είναι η κλωνοποίηση με μεταφορά πυρήνα από σωματικά κύτταρα. Η μεταφορά πυρήνα περιλαμβάνει την αντικατάσταση του γενετικού υλικού του πυρήνα ενός ωοκυττάρου με εκείνον ενός εξωγενούς διπλοειδούς κυττάρου. Στη συνέχεια ενεργοποιείται το ωάριο προκείμενου να ξεκινήσει ο πρώτος κυτταρικός κύκλος. Το έμβρυο που προκύπτει εμφυτεύεται σε έναν θετό δέκτη ο οποίος αναλαμβάνει την ολοκλήρωση της κύησης. Η τεχνολογία αυτή αναπτύχθηκε για πρώτη φορά στο πρόβατο με την κλωνοποίηση της Dolly (7) και έκτοτε έχει βρει εφαρμογή με επιτυχία και στο χοίρο (8).

3. Η μεταφορά γονιδίων διαμέσου ρετροϊών – φορέων
Προκειμένου να αυξηθεί η πιθανότητα έκφρασης ενός γονιδίου, η μεταφορά του μεσολαβείται διαμέσου ενός φορέα, συνήθως ρετροϊού, λεντι-ιού ή  πλασμιδίου. Οι ιοί χρησιμοποιούνται συνήθως για τη μεταφορά γενετικού υλικού σε ένα κύτταρο, εκμεταλλευόμενοι την ικανότητα τους να μολύνουν τα κύτταρα με τον τρόπο αυτό. Οι απόγονοι που προκύπτουν είναι χίμαιρες. Η μετάδοση του ανασυνδυασμένου γονιδίου στους απογόνους είναι δυνατή μόνο εάν ο ιός ενσωματωθεί στα γεννητικά κύτταρα. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1974 σε μυς (9).

Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων διαμέσου των σπερματοζωαρίων
Σύγχρονες μέθοδοι παραγωγής διαγονιδιακών ζώων περιλαμβάνουν παρεμβάσεις στα σπερματοζωάρια και παρουσιάζουν διάφορες παραλλαγές:

(α) Κεφαλές σπερματοζωαρίων επωάζονται με ανασυνδυασμένο DNA και στη συνέχεια διενεργείται in vitro γονιμοποίηση με την τεχνική της ενδοκυτταροπλασματικής έγχυσης (ICSI) προς δημιουργία διαγονιδιακών ζώων (10). Εναλλακτικά, επωάζονται άρτια σπερματοζωάρια με DNA και στη συνέχεια διενεργείται in vitro γονιμοποίηση (11).

(β) Μία άλλη τεχνική περιλαμβάνει την έγχυση συμπλόκου πλασμιδίου DNA – λιποσώματος στα σπερματικά σωληνάρια αρσενικών ζώων τα οποία στη συνέχεια οδηγούνται σε σύζευξη προς παραγωγή διαγονιδιακών ζώων (12).

(γ) Το ανασυνδυασμένο γονίδιο μπορεί να εισαχθεί, με τη βοήθεια λεντι-ιών – φορέων, σε σπερματογόνια τα οποία στη συνέχεια εμφυτεύονται σε όρχεις. Η σύζευξη αυτών των αρσενικών  οδηγεί στην παραγωγή διαγονιδιακών ζώων (13).

Με την εφαρμογή των παραπάνω μεθόδων, η πιθανότητα παραγωγής απογόνων που να φέρουν το τροποποιημένο DNA ποικίλει και είναι συνήθως μικρή. Γι' αυτό απαιτείται ο γενετικός έλεγχος, αρχικά, των ζώων πρώτης γενεάς (F1). Εάν το τροποποιημένο γονίδιο έχει κατορθώσει να εισχωρήσει στα γεννητικά κύτταρα, τα χιμαιρικά ζώα αναπαράγονται αμιγώς για 10-20 γενεές έως ότου επιτευχθούν ομόλογα διαγονιδιακά ζώα στα οποία το γονίδιο είναι παρόν σε κάθε κύτταρο.

ΗΘΙΚΟΙ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΙΣΜΟΙ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Σημαντικά ερωτήματα εγείρονται σχετικά με την ηθική της χρήσης των διαγονιδιακών ζώων ως ζωντανών μηχανών για την παραγωγή πρωτεϊνών, αντισωμάτων κλπ. καθώς και για τις επιπτώσεις που έχει στο περιβάλλον η δραστική παρέμβαση του ανθρώπου στο γονιδίωμα οργανισμών των οποίων το DNA έχει διαμορφωθεί μετά από εκατοντάδες χιλιάδες χρόνια εξέλιξης. Οι προβληματισμοί αυτοί θα πρέπει να απασχολήσουν την επιστημονική κοινότητα και να συμβάλλουν στη θέσπιση κανόνων ηθικής δεοντολογίας για την εφαρμογή της σύγχρονης αυτής τεχνολογίας προς όφελος του ανθρώπινου γένους με τις ελάχιστες δυνατές συνέπειες στο υπόλοιπο οικοσύστημα.
Δε θα πρέπει να λησμονούμε, ότι σε επίπεδο έρευνας, η δημιουργία διαγονιδιακών ζώων έχει συμβάλει στην αύξηση της τάσης για χρήση ζώων εργαστηρίου χαμηλότερου εξελικτικού σταδίου, όπως π.χ. τα ποντίκια, προς όφελος ζώων ανώτερου εξελικτικού σταδίου, όπως σκύλοι, πίθηκοι κλπ, και παράλληλα έχει μειώσει δραστικά τον αριθμό των χρησιμοποιούμενων πειραματοζώων, ιδιαίτερα εκείνων που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία μοντέλων μελέτης ανθρώπινων ασθενειών.
Κάθε νέα τεχνολογία αποτελεί πρόκληση για τον επιστήμονα μέχρι να εξαντλήσει τις δυνατότητες που αυτή του προσφέρει, παράλληλα όμως κρύβει πλήθος κινδύνων προτού διερευνηθούν οι βραχυπρόθεσμες αλλά και οι μακροπρόθεσμες αρνητικές επιπτώσεις που μπορεί να έχει. Για το λόγο αυτό ο ενθουσιασμός των πολυάριθμων καταλυτικών παρεμβάσεων της σύγχρονης διαγονιδιακής τεχνολογίας, επιβάλλεται να συνδυάζεται με συνετή και πάντοτε τεκμηριωμένη χρήση της.   
Συμπερασματικά, η διαγονιδιακή τεχνολογία, τηρουμένων των αναλογιών μεταξύ οφέλους για τον άνθρωπο και επιπτώσεων στο περιβάλλον και τα υπόλοιπα ζωικά είδη, μπορεί να προσφέρει σημαντικές υπηρεσίες σε πολλούς τομείς, συμπεριλαμβανομένης της κτηνοτροφίας, της ιατρικής και της βιομηχανίας, ανοίγοντας ένα  νέο ορίζοντα στην αντιμετώπιση πληθώρας δυσεπίλυτων προβλημάτων.


BIBΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.    Brinster R. The effect of cells transferred into mouce blastocyst on subsequent development. J Exp Med 1974; 140: 1049-56
2.    Gordon JW, Ruddle FH. Integration and stable germ line transformation of genes injected into mouse pronuclei. Science 1981; 83: 9065-9
3.    Bolon B, Gallbreath E, Sargent L, Weiss J. Genetic engineering and molecular technology. In KrinkleGJ (ed). The laboratory rat. Academic Press, London, 2000, p.603-34
4.    Nakagata N. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J Reprod Fertil 1993;99:77-80.   
5.    Wakayama T, Yanagimachi R. Development of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nat Biotechnol. 1998;16:639-41
6.    Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:9065-9.  
7.    Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810-3
8.    McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 2000; 405: 1066-9
9.    Jaenisch R,  Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci USA  1974; 71: 1250-4
10.    Kato M, Ishikawa A, Kaneko R, Yaji T, Hochi S, Hirabayashi M. Production of transgenic rats by ooplasmic injection of spermatogenic cells exposed to exogenous DNA: a preliminary study. Mol Reprod Dev 2004; 69: 153-8
11.    Celebi C, Guillaudeux T, Auvray P, Vallet- Erdtmann V, Jegou B. The making of "transgenic soermatozoa". Biol Reprod 2003; 68: 1477-83
12.    Chang K, Ikeda A, Hayashi K, Furuhata Y, Nishihara M, Ohta A, Ogawa S, Takahashi M, Production of transgenic rats and mice by the testis-mediated gene transfer. J Reprod Develop 1999; 45: 29-36.
13.    Hamra FK, Gatlin J, Chapman KM, Grellhesl DM, Garcia JV, Hammer RE, Garbers DL. Production of transgenic rats by lentiviral tranduction of male germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 14931-6